Pathogenesis of the initial stages of severe COVID-19

Full Text

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

11 марта 2020 года Всемирная организация здравоохранения объявила COVID-19 пандемией. За время пандемии COVID-19 коронавирус SARS-CoV-2 заразил 167 011 807 человек во всем мире (по состоянию на 25.05.2021) с зарегистрированной смертностью 3 472 068 человек [1]. Развитие смертельных осложнений COVID-19 ускоряется из-за острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), вторичных инфекций, сепсиса и полиор-ганной недостаточности [2]. Около 5% пациентов с COVID-19 имеют тяжелые симптомы, включая септический шок, ОРДС и дисфункцию органов, в то время как у 80% пациентов симптомы легкие или отсутствуют [3].

ИНФЕКТИВНОСТЬ

COVID-19 затрагивает множество систем органов множеством способов. Эти разнообразные проявления связаны с вирусным тропизмом и иммунным ответом организма инфицированного человека, но точные механизмы еще не вполне выяснены. На широкий органотропизм SARS-CoV-2 указывает присутствие вирусных компонентов (РНК, белки) во многих органах человека, включая глотку, трахею, легкие, сердце, сосуды, кровь, кишечник, мозг, почки, печень и семенники, а также в различных жидкостях организма, таких как слюна, слизь, моча, спинномозговая жидкость, сперма и грудное молоко. Вирус SARS-CoV-2 инфицирует клетки с помощью ангиотензинпревращающего фермента 2 (angiotensin-converting enzyme-2, ACE2) — полифункционального мембраносвязанного рецептора, который присутствует на клеточных мембранах всех органов и делает ткани уязвимыми для вторжения вируса [4-7]. Клеточная серинпротеаза TMPRSS2 (transmembrane protease serine 2) способствует проникновению коронавируса, расщепляя вирусный S-белок и рецептор ACE2 и способствуя этим слиянию вируса с клеточной мембраной и интернализации вируса в клетку-мишень [4]. Экспрессия ACE2 и протеазы TMPRSS2 (и, возможно, других корецепторов) широко распространена на клетках многих тканей, включая носовые бокаловидные секреторные клетки; клетки верхних дыхательных путей; альвеолярные эпителиальные клетки типа 2; эпителиальные клетки пищевода; железистые клетки желудка; энтероциты кишечника; холангиоциты; макрофаги; миоциты сердца и скелетных мышц; клетки проксимальных канальцев почек, мочевого пузыря, печени, нервной системы и сетчатки; париетальные клетки клубочков; эндотелиальные клетки сосудов и кератиноциты [8-13]. Клеточные линии различного тканевого происхождения с гиперэкспрессирей ACE2 допускают различные уровни инфекции SARS-CoV-2, в основном восприимчивость клеток к инфекции коррелирует с уровнем экспрессии ACE2. Когда ACE2 и TMPRSS2 экспрессируются вместе, большинство клеточных линий становятся очень восприимчивыми к инфекции [14].

Анализ экспрессии ACE2 в 31 ткани человека по данным проектов Genotype-Tissue Expression (GTEx) и The Cancer Genome Atlas (TCGA) обнаружил самую высокую экспрессию рецептора в тонком кишечнике, за которым следуют почки, семенники, сердце, легкие, щитовидная железа и жировая ткань, самую низкую — в крови, селезенке, костном мозге, кровеносных сосудах и мышцах [15]. Это распределение подтверждают S.D. Unudurthi и соавт. [16]. Умеренные уровни экспрессии ACE2 обнаружены в легких, толстом кишечнике, печени, мочевом пузыре и надпочечниках. В сердце человека экспрессия ACE2 низка в кардиомиоцитах и высока в перицитах [17]. Экспрессия ACE2 в кардиомиоцитах значительно повышена у пациентов с сердечными заболеваниями. Более низкие уровни экспрессии наблюдались в фибробластах, эндотелиальных клетках и лейкоцитах. Присутствие этого рецептора объясняет широкий спектр симптомов и осложнений COVID-19, таких как потеря вкуса и обоняния, респираторные и желудочно-кишечные расстройства, а также полиорганная дисфункция, включая повреждение сердца, печени, почек и мозга [18]. Иммуногистохимические исследования подтверждают, что тонкий кишечник экспрессирует более высокие уровни мРНК ACE2, чем любой другой орган. Двенадцатиперстная кишка, почки и яички также показали сильные сигналы, тогда как в дыхательных путях сигнал был слабым [19].

Коронавирус SARS-CoV-2 использует гликопротеин вирусного шипа (S-белок) для прикрепления и проникновения в клетку [20]. Аффинность связывания S(spike)-белка вируса SARS-CoV-2 c АСЕ2 в 10-20 раз выше, чем S-белка вируса SARS-CoV [21]. Полость рта представляет собой одно из основных мест инфекции SARS-CoV-2 и способствует передаче вируса через слюну. Анализ экспрессии S-белка подтвердил присутствие вируса в слюнных железах и слизистой оболочке полости рта. Слюна людей, инфицированных SARS-CoV-2, содержит эпителиальные клетки, экспрессирующие ACE2 и РНК SARS-CoV-2. Динамика выделения вируса и количество вирусных частиц в слюне коррелируют с выраженностью симптомов COVID-19, включая потерю вкуса. После выздоровления в слюне обнаруживаются антитела против белков SARS-CoV-2. Секвенирование РНК единичных клеток (single cell RNA sequencing, scRNAseq) выявило уникальное анатомическое и клеточное разнообразие полости рта и ротоглотки, которое влияет на чувствительность к инфекции. Секреторный эпителий слюнных желез экспрессирует основные факторы входа в эпителий, а совместная экспрессия ACE2 и TMPRSS2 обнаружена в слизистых, протоковых и миоэпителиальных клетках. Подтверждена широкая экспрессия факторов проникновения вируса и значительная инфекция эпителия малых слюнных желез на языке, нёбе и слизистых оболочках, которые являются очагами заражения SARS-CoV-2. Инфекция слюнных желез и языка объясняет симптомы COVID-19, такие как сухость во рту и изменение вкуса; отсутствие таких симптомов объясняет феномен «тихих распространителей» COVID-19. Наличие инфицированных вирусом SARS-CoV-2 клеток плоского эпителия в слюне обеспечивает механизм распространения заболевания. Обнаружение орального источника инфекции и репликации SARS-CoV-2 в слюнных железах и естественного канала распространения вируса через слюну подчеркивает необходимость одновременного тестирования оральных и носоглоточных участков. Принимая во внимание документально подтвержденную оральную инфекцию SARS-CoV-2 и легкость передачи через слюну, бессимптомная передача SARS-CoV-2 считается «ахиллесовой пятой» этой пандемии, так как является причиной до 45% случаев COVID-19. Эти данные представляют убедительные доказательства в поддержку универсальных мер общественного здравоохранения, включая ношение масок, социальное дистанцирование и мытье рук для ограничения воздействия потенциально инфекционных аэрозолей и фомитов из полости рта [22].

В первую очередь вирус SARS-CoV-2 поражает легкие, вызывая у части пациентов ОРДС и дыхательную недостаточность, которые являются одной из основных причин смерти пациентов с COVID-19 [23]. Однако, по мере того как становятся доступными и исследуются на наличие вирусных белков или частиц образцы тканей от инфицированных и/ или умерших людей, растет понимание того, что SARS-CoV-2 может поражать внелегочные органы. Репликация вируса обнаружена в кишечнике [14, 24, 25], легких, пищеводе, печени и почках [14, 26, 27], сердце [14, 27, 28] и головном мозге [14, 27, 29]. Максимальное число копий SARS-CoV-2 на клетку обнаружено в дыхательных путях, а более низкие уровни — в почках, печени, сердце, головном мозге и крови. Эти данные указывают на широкий органотропизм SARS-CoV-2.

Данные о локализации вирусных рецепторов могут дать представление о механизмах проникновения вируса, тканевом тропизме и патогенезе заболевания, поэтому представляет интерес изучение возможной корреляции симптомов COVID-19 с характером распределения ACE2. Ангиотен-зинпревращающий фермент (АПФ, АСЕ) известен своей ролью в регуляции артериального давления посредством превращения декапептида ангиотензина I (AngI) в активный октапептид ангиотензин II (AngII) и расщепления брадикинина и нейротензина. Хотя АСЕ и ACE2 имеют значительную гомологию последовательностей в каталитических доменах, они действуют на разные пептидные субстраты ангиотензинов. Исследования генной онтологии выявили новые данные о потенциальной физиологической роли ACE2. Пять наиболее значимых терминов генной онтологии включают ангиогенез, морфогенез кровеносных сосудов, развитие сосудистой сети, развитие сердечно-сосудистой системы и развитие кровеносных сосудов. Анализ генной онтологии также установил, что ACE2 участвует в «каскаде комплемента и коагуляции» [19]. Действительно, пациенты с тяжелой формой COVID-19 часто имеют нарушения свертывания крови, которые имитируют системные коагулопатии, такие как диссеминированное внутрисосудистое свертывание (ДВС) и тромботическая микроангиопатия, но COVID-19 имеет свои отличительные особенности (более сильное повышение концентрации D-димера, умеренное снижение количества тромбоцитов и незначительное удлинение протромбинового времени, которое может остаться незамеченным, если выражается как международное нормализованное отношение) [30]. Таким образом, ангио-генез/морфогенез кровеносных сосудов можно рассматривать как еще одну предполагаемую функцию ACE2 в дополнение к его классической роли как ключевого ангиотензин(1-7)-формирующего фермента [19].

Исследования проникновения SARS-CoV-2 в клетку почти полностью сосредоточены на ACE2.

Низкие уровни экспрессии ACE2 в клетках дыхательного и обонятельного эпителия указывают на участие в этом процессе кофакторов, необходимых для облегчения взаимодействия вируса с такими клетками. Трансмембранный клеточный рецептор нейропилин-1 (neuropilin receptor-1, NRP1) представляет собой такой фактор, усиливающий взаимодействие вируса с ACE2 [31]. Трансмембранная протеаза фурин расщепляет полноразмерный S-белок вируса SARS-CoV-2 на два связанных полипептида (S1 и S2) с образованием карбокситер-минальной аминокислотной последовательности Arg-Arg-Ala-Arg (RRAR) на субъединице S1, что увеличивает ассоциацию вируса с NPR1, который экспрессируется в респираторном и обонятельном эпителии и регулирует биологические процессы, включая рост аксонов, ангиогенез и проницаемость сосудов [20]. Связывание SARS-CoV-2 с рецептором NPR1 увеличивает его тропизм и инфективность в клеточных культурах и in vivo. Субъединица S1 вирусного S-белка, несущая рецепторсвязывающий домен (receptor binding domain, RBD), связывается с ACE2, в то время как трансмембранная субъединица S2 способствует слиянию вирусной оболочки с клеточной мембраной хозяина. Сочетание высокого сродства к рецептору ACE2 и повышенного тропизма из-за присутствия многоосновного сайта расщепления в его спайковом белке увеличивает способность SARS-CoV-2 инфицировать внелегочные органы по сравнению с другими коронавирусами, следовательно, входные рецепторы и протеазы представляют собой потенциальные терапевтические мишени для борьбы с инфекцией SARS-CoV-2 [16].

Наличие сайта расщепления фуринового типа (RRAR) на стыке субъединиц S1 и S2 в S-белке вируса SARS-CoV-2, который отсутствует у SARS-CoV, объясняет ускоренное распространение SARS-CoV-2. Подобные последовательности обнаружены в S-белках многих других патогенных вирусов человека, включая вирус Эбола, ВИЧ-1 и высоковирулентные штаммы птичьего гриппа. Присутствие сайта расщепления RRAR у SARS-CoV-2 приводит к повышенной патогенности за счет активации связывания с рецепторами клеточной поверхности. Процессинг, опосредованный фурином, влияет на тропизм SARS-CoV-2 и увеличивает инфекционность. Связывая расщепленные фурином субстраты, NRP1 значительно усиливает цитопатическую активность вируса SARS-CoV-2, однако инфективность мутантного SARS-CoV-2 с измененным сайтом расщепления фурином не зависит от NRP1 [31]. Образующиеся при расщеплении белки S1 и S2 остаются нековалентно связанными с серинпротеазой TMPRSS2. Блокирование этих взаимодействий, в том числе ингибирование фурина, с помощью селективных ингибиторов снижает проникновение SARS-CoV-2 в клетки. Таким образом, рецептор NRP1 служит кофактором взаимодействия вируса с ACE2 и потенциальной терапевтической мишенью для COVID-19. С помощью последовательного окрашивания с использованием антител против белков SARS-CoV-2 (чтобы различать внеклеточные и внутриклеточные вирусные частицы) установлено, что истощение NRP1 не влияет на связывание SARS-CoV-2 с поверхностью клеток, но уменьшает интернализацию вируса [20].

Экспрессия РНК NRP1 и его гомолога NRP2 повышена в SARS-CoV-2-позитивных клетках по сравнению с соседними неинфицированными клетками в жидкости бронхоальвеолярного лаважа тяжелобольных пациентов с COVID-19. В ткани легкого и обонятельном эпителии ACE2 экспрессируется на очень низких уровнях, а NRP1 и NRP2 обильно экспрессированы почти во всех легочных и обонятельных клетках, с самыми высокими уровнями экспрессии в эндотелиоцитах. В связи с нарушением обоняния у значительной части пациентов с COVID-19 и присутствия NRP1 в обонятельном эпителии проведен иммуногистохимический анализ аутопсий пациентов с COVID-19. Иммунореактивность NRP1 обнаружена в поверхностном слое респираторного и обонятельного эпителия человека. ACE2 практически не обнаруживался в этих тканях. Внутри обонятельного эпителия NRP1 наблюдался в клетках, позитивных по фактору транскрипции олигодендроцитов (oligodendrocyte transcription factor 2, OLIG2), который в основном экспрессируется предшественниками обонятельных нейронов [31].

Система геномного редактирования CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) использована группой специалистов ряда крупнейших медицинских центров США как инструмент скрининга геномов инфицированных клеток. Кроме генов ACE2, TMPRSS2 и CTSL, кодирующих известные факторы инфективности, рецептор ACE2, протеазы TMPRSS2 и катепсин L, обнаружены другие гены, влияющие на инфективность SARS-CoV-2, в том числе HMGB1 (high-mobility group box 1). Плейотропный ядерный белок HMGB1, который связывает нуклеосомы, транспортирует генетический материал и функционирует как секретируемый алармин в ответ на вирусную инфекцию, регулирует экспрессию ACE2 и имеет решающее значение для проникновения SARS-CoV и SARS-CoV-2 в клетку. Примечательно, что HMGB1 регулирует экспрессию ACE2 внутриклеточно, а не через свою функцию цитокина или алармина, что предполагает особый механизм действия HMGB1 при инфекции SARS-CoV-2. Низкомолекулярные антагонисты идентифицированных генных продуктов ингибируют заражение вирусом SARS-CoV-2 клеток человека и обезьян, демонстрируя консервативную роль этих генетических совпадений у разных видов. Этот подход выявляет клеточные факторы инфективности, регулирующие восприимчивость к коронавирусам, и определяет специфичные для SARS-CoV-2 терапевтические мишени [32].

АСЕ и ACE2 действуют как цинк-металлопептидазы, выполняя уравновешивающую функцию в ренин-ангиотензин-альдостероновой системе (РААС), но обладают различной субстратной специфичностью, определяющей их различные роли в РААС. Большая часть ACE2 находится в нерастворимой форме, связанной с клеточными мембранами. Как в растворимой, так и в нерастворимой форме ACE2 превращает AngI в ангиотензин-(1-9) и AngII в ан-гиотензин-(1-7); ACE2 в отличие от вазоактивного ACE не расщепляет брадикинин и нечувствителен к обычным ингибиторам ACE. Ангиотензин-(1-7) контролирует различные опасные процессы в организме, такие как воспаление, ангиоспазм и тромбоз, противодействует вазоконстрикторному эффекту AngII, проявляет антифиброзные, антиоксидантные и антигипертрофические защитные свойства и способствует развитию ангиогенеза в поврежденной ткани при инфаркте миокарда и инсульте [19]. Экспрессия ACE2, по-видимому, защищает легкие от повреждения. Низкая активность ACE2 в легких способствует их воспалению и быстрой инфильтрации нейтрофилов, усиливающей воспаление. Ангиотензин-(1-9) продемонстрировал защитное действие на ремоделирование сердца и сосудов при COVID-19 [10].

Белки ACE2 и TMPRSS2 экспрессируются в эндотелиальных клетках, что обусловливает их восприимчивость к SARS-CoV-2 в качестве клеток-мишеней. ACE2 является центральным негативным регулятором РААС [10, 18]. После проникновения в клетку вирус устраняет ACE2 с поверхности клетки, ослабляет активность и защитные функции рецептора, что приводит к дисбалансу РААС. Следовательно, кроме легочных последствий, таких как ОРДС, инактивация ACE2 имеет большой потенциал ухудшать здоровье сердечно-сосудистой системы [33, 34]. Низкая экспрессия ACE2, вызванная различными причинами (пожилой возраст, диабет, гипертония), увеличивает тяжесть инфекции SARS-CoV-2 [35]. Это согласуется с эпидемиологической статистикой, показывающей, что большинство пациентов с серьезными и фатальными проявлениями COVID-19 — это пожилые люди и пациенты с сердечно-сосудистыми заболеваниями [36]. У пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, с различными факторами риска, такими как гипертония, сердечно-сосудистые заболевания, диабет и пожилой возраст, обнаружен дефицит ACE2. Таким образом, подавление активности ACE2 вирусом может быть особенно вредным для людей с исходным дефицитом ACE2. Дальнейшее снижение экспрессии ACE2 после заражения SARS-CoV-2 может усилить дисбаланс между защитной и неблагоприятной ролью РААС. Нарушение регуляции этой оси в легких приводит к тромботическим и воспалительным состояниям [35]. Повышенный калийурез как маркер активации РААС может быть связан с высоким уровнем AngII у пациентов с COVID-19 [37].

Помимо РААС, ACE2 связан с калликреин-кининовой системой, активация которой приводит к высвобождению брадикинина и играет важную роль в воспалительном процессе. Одна из функций ACE2 — гидролиз активного метаболита брадикинина ([des-Arg973]-bradykinin, DABK). После связывания SARS-CoV-2 c рецептором ACE2 для входа в клетку происходит потеря функции ACE2, вызванная эндоцитозом и активацией протеолитического расщепления и процессинга ACE2 [4, 10]. Инвазия SARS-CoV-2 снижает экспрессию ACE2, подавляет его защитные, в том числе противовоспалительные, функции и усиливает эффекты AngII у инфицированных пациентов [35, 38], приводя к легочному воспалению, тромбозу и острому повреждению почек [3]. Снижение уровней и ослабление активности ACE2 из-за вирусной инфекции приводит к нарушению инактивации DABK, усилению передачи сигналов через рецептор брадикинина B1R (bradykinin B1 receptor) и активации калликреин-кининовой системы через B1R, что в свою очередь увеличивает привлечение лейкоцитов и экстравазацию жидкости в легких. Блокирование продукции брадикинина или его рецепторов может открыть новое терапевтическое окно для лечения COVID-19-ассоцииро-ванного ОРДС, особенно до того, как заболевание перейдет в необратимую стадию [39].

Калликреины обнаружены во многих тканях человека, в том числе в эпителии верхних и нижних дыхательных путей. Существуют два классических пути образования кининов — плазменный и тканевый. Субстратом плазменного калликреина является брадикинин, а субстратом тканевых кал-ликреинов — низкомолекулярный кининоген, приводящий к образованию декапептида лизилбради-кинина (каллидина). После активации фактора FXIIa калликреин плазмы расщепляет брадикинин, высвобождая нонапептид брадикинин-1-9. Во время воспаления плазмин усиливает расщепление брадикинина калликреином плазмы. Каллидин и его активный метаболит DABK связываются с двумя разными рецепторами: каллидин является лигандом рецептора B2 (B2R), DABK — основной агонист рецептора B1R. B2R конститутивно экспрессируется в клетках млекопитающих (например, эндотелиальных и гладкомышечных клетках), тогда как экспрессия B1R в основном индуцируется цитокинами во время инфекций и иммунопатологии. Через B2R брадикинин активирует сигнальные пути, что приводит к расширению и увеличению проницаемости сосудов, развитию отеков, гипотонии, боли, лихорадке — типичным клиническим признакам COVID-19. Брадикинин является одним из самых мощных медиаторов воспаления, способным стимулировать продукцию супероксидных радикалов, оксида азота, гистамина, арахидоновой кислоты, простагландина E2, простациклина, воспалительных цитокинов, таких как интерлейкины 1 и 6 (interleukin, IL-1, IL-6), фактор некроза опухоли альфа (tumor necrosis factor, TNF-a), и тканевого активатора плазминогена (tissue plasminogen activator, t-PA). О тесной связи калликреин-кининовой системы и РААС свидетельствует тот факт, что B2R образует гомо- и гетеродимеры с несколькими рецепторами РААС, участвующие в регуляции некоторых физиологических функций, включая регуляцию риска тромбоза. B1R опосредует несколько реакций, включая вазодилатацию, гипотонию и повышенную проницаемость сосудов — все это типичные особенности COVID-19. У инфицированных вирусом SARS-CoV-2 людей повышена экспрессия генов калликреинов и рецепторов брадикинина [40].

На роль брадикинина в патогенезе COVID-19 указывают некоторые клинические особенности, наблюдаемые у пациентов. F.L. van de Veerdonk и соавт. [41] полагают, что ангионевротический отек легких из-за активации рецепторов брадикинина B1R и B2R на эндотелиальных клетках легких является важной особенностью COVID-19 и что блокирование этих рецепторов и ингибирование активности плазматического калликреина на ранних стадиях заболевания может предотвратить ОРДС. В отличие от B2R, рецептор B1R на эндотелиоцитах активируется провоспалительными цитокинами. Потеря активности ACE2 при остром повреждении легких приводит к усилению B1R-зависимого сиг-налинга, повышению сосудистой проницаемости и ангионевротическому отеку. Ангионевротический отек является симптомом уже ранней стадии заболевания и может объяснить типичные компьютерные томограммы и ощущение пациентов, что они тонут. У некоторых пациентов это сопровождается клиническим обострением заболевания примерно на 9-й день из-за образования антител против S-белка коронавируса, что может способствовать прогрессированию заболевания за счет притока иммунных клеток и провоспалительных цитокинов. Параллельно воспаление вызывает усиление экспрессии B1R, которое приводит к продолжающейся дисфункции ACE2 в легких из-за персистенции вируса. При этом ключевая роль отведена брадикинину и DABK. РААС строго контролирует кининовую систему. ACE расщепляет брадикинин, а ACE2 расщепляет DABK. Таким образом, ACE и ACE2 действуют как регуляторные тормоза в кининовой системе. Когда ACE2 соединяется с SARS-CoV-2 и интернализируется в клетку во время инфекции, внеклеточные уровни и функции фермента снижаются, в результате брадикининовый сигналинг переходит в режим перегрузки [40].

Этот молекулярный механизм COVID-19, получивший название «брадикининовый шторм», обеспечивает точки терапевтического вмешательства, которые могут быть устранены с помощью существующих фармацевтических препаратов, одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (Food and Drug Administration, US FDA). Например, икатибант (торговая марка Firazyr) представляет собой антагонист брадикининовых рецепторов. Экаллантид, мишенью которого является калликреин, подавляет продукцию брадикинина. Анализ экспрессии генов в клетках бронхоальвеолярного лаважа пациентов с COVID-19 выявляет критический дисбаланс в РААС, представленный снижением экспрессии ACE в сочетании с увеличением экспрессии ACE2, ренина, ангиотензина, ключевых рецепторов РААС и кал-ликреиновых ферментов, а также обоих рецепторов брадикинина. Этот нетипичный паттерн РААС повышает уровни брадикинина во многих тканях и органах и вызывает гипотонию, вазодилатацию и увеличение проницаемости сосудов. Вызванное брадикининовым штормом истечение жидкости в легкие в сочетании с избытком гиалуроновой кислоты приводит к образованию гелеобразного вещества, которое нарушает газообмен в легких пациентов с тяжелой COVID-19. Таким образом, брадикининовый шторм может быть ответственным за наиболее серьезные симптомы COVID-19. Авторы считают, что патология COVID-19 является результатом скорее брадикининового, нежели цитокинового шторма (хотя эти два явления не являются взаимоисключающими) [42].

ИММУННАЯ СИСТЕМА

Нарушение регуляции иммунных ответов при COVID-19

SARS-CoV-2 может индуцировать иммунный ответ в две фазы: (1) ранний специфический приобретенный иммунный ответ для уничтожения вируса и подавления прогрессирования заболевания и (2) неконтролируемое воспаление как механизм, ответственный за развитие ОРДС. Инфекция SARS-CoV-2 запускает местный иммунный ответ, включая привлечение клеточных популяций врожденного иммунитета и генерацию вирусоспецифичных адаптивных B- и T-клеточных ответов, которые в большинстве случаев разрешают инфекцию с минимальным воспалением и повреждением легких. В течение трех недель после появления симптомов все пациенты дают положительный результат на антивирусный иммуноглобулин G (immunglobulin, IgG); сероконверсия на IgM и IgG может происходить последовательно или одновременно [12]. Большинство людей быстро выздоравливают от COVID-19, вырабатывая антитела к этой инфекции. Однако медленная реакция иммунной системы может иметь фатальные последствия, поэтому гуморальный ответ не исключает смерть. Решающее значение для прогноза имеет скорость заражения и иммунного ответа [5].

Активация иммунной системы и выработка воспалительных цитокинов необходимы для естественных противовирусных иммунных ответов. Вирус размножается и поражает ткани при неэффективных иммунных ответах. Связывание SARS-CoV-2 с рецептором ACE2 и репликация вируса в клетках легких приводят к апоптозу эпителиальных и эндотелиальных клеток, пироптозу лимфоцитов и макрофагов, транссудации и воспалению в нижних дыхательных путях, которое запускается антигенпрезентирующими клетками [43]. Вирус проникает в макрофаги, и они представляют вирусный антиген Т-лимфоцитам CD4+, высвобождая IL-12 для дальнейшей активации Т-хелперов 1 (Th1). Активированные Th1 -клетки стимулируют B-лимфоциты к выработке антигенспецифичных антител и цитотоксические Т-клетки-киллеры CD8+ против инфицированных клеток-мишеней, содержащих вирусный антиген [44]. T-клетки CD8+ обладают цитотоксическим эффектом как прямого действия, так и за счет продукции провоспалительных цитокинов. У пациентов с COVID-19 уровни цитокинов и хемокинов повышены. Однако гиперактивация иммунной системы во время инфекции COVID-19 приводит к резкому увеличению циркулирующих уровней провоспалительных цитокинов — цитокиновому шторму, который клинически характеризуется системным воспалением, гиперферритинемией, нарушением гемодинамики и полиорганной недостаточностью [3]. Цитокино-вый шторм стимулирует некроз или апоптоз Т-лимфоцитов, особенно в случаях тяжелого течения заболевания. Следовательно, неограниченное воспаление вредит клиренсу вируса, способствуя истощению Т-клеток CD4+ и CD8+ [45, 46]. SARS-CoV-2 может напрямую инфицировать и реплицироваться в B- и T-лимфоцитах, запуская в них апоптоз [47], более выраженный в Т-клетках CD8+ [48]. Во время инфекции SARS-CoV-2 у пациентов наблюдаются системные симптомы различной степени тяжести, которые связаны с агрессивной воспалительной реакцией и высвобождением большого количества провоспалительных цитокинов. У пациентов с тяжелой и среднетяжелой формой COVID-19 повышен уровень циркулирующих IL-1e, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-15, IL-18, FGF, G-CSF, GM-CSF, IFN-y, IP-10, MCP-1, MIP-1a, MIP-1p, PDGF, TNF-a и VEGF. Исследования, анализирующие профили цитокинов у пациентов с COVID-19, показали прямую корреляцию между цитокиновым штормом и повреждением легких, ОРДС, полиорганной недостаточностью и неблагоприятным прогнозом [49-53].

При дисрегулированных иммунных ответах прямой цитопатический эффект SARS-CoV-2 может вызывать пироптоз — наиболее иммуногенную и высоковоспалительную форму программированной гибели клеток с высвобождением эндогенных сигналов опасности (например, вирусной РНК), которые распознаются макрофагами, эпителиальными и эндотелиальными клетками. Возникает каскад местного воспаления, характеризующийся секрецией провоспалительных цитокинов и хемокинов и привлечением моноцитов, макрофагов и Т-лимфоцитов, которые опосредуют обширную патологию, достигающую кульминации в виде ОРДС [12]. Цитокиновый шторм выливается в кровоток, о чем свидетельствуют высокие сывороточные уровни воспалительных цитокинов IL-6, IL-8, IL-17, G-CSF, GM-CSF, IP10, MCP1, MIP1a, TNFa и хемокинов CCL2, CCL3, CXCL10 у пациентов с тяжелой формой COVID-19, который может привести к септическому шоку и полиорганной недостаточности [48]. Про-воспалительные цитокины также могут вызывать синдром повышенной проницаемости капилляров, тромбоз, ДВС-синдром [54]. Активация макрофагов цитокинами приводит к эритрофагоцитозу, анемии, нарушению сосудистого гемостаза и полиорганной недостаточности [55].Тяжелое повреждение легких у некоторых пациентов с COVID-19 объясняется гиперактивацией провоспалительных Th17, высокой цитотоксичностью Т-клеток CD8+ и низким уровнем интерферонового ответа на SARS-CoV-2 [49, 56]. Независимо от того, является ли цитокиновый шторм частью синдрома высвобождения цитокинов (cytokine release syndrome, CRS) или вторичного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза, также называемого синдромом активации макрофагов, результатом является стойкое повышение уровней воспалительных цитокинов [52].

Считается, что для эффективного контроля инфекции SARS-CoV-2 необходимы как цитотоксические, так и гуморальные адаптивные реакции. Вирусспецифичные Т-клетки имеются у большинства пациентов, и величина антиген-специфичных Т-клеточных ответов не связана с тяжестью заболевания. Однако у некоторых пациентов индуцируется чрезмерный выброс цитокинов по неизвестным в настоящее время причинам, что вызывает цитокиновый шторм, который приводит к тяжелому поражению легких и ОРДС [57]. В конечном итоге, в 70% летальных исходов смерть вызвана дыхательной недостаточностью из-за ОРДС и в 28% — полиорганной недостаточностью, связанной с сепсисоподобным цито-киновым штормом [58].

Цитокиновый шторм связан с гипервоспалительным повреждением органов во время COVID-19. Исследования пациентов с COVID-19 выявили взаимосвязь между тяжестью заболевания и притоком клеток врожденного иммунитета и воспалительных цитокинов [50, 56, 59]. Кроме того, инфицированные SARS-CoV-2 мононуклеарные клетки периферической крови от здоровых доноров показали повышенную продукцию провоспалительных цитокинов. Понимание молекулярного пути, по которому SARS-CoV-2 вызывает гиперактивную воспалительную реакцию, имеет решающее значение для разработки эффективных терапевтических подходов. Ни один из цитокинов индивидуально не индуцирует гибель макрофагов даже в 10-кратной концентрации. Однако цитокиновый коктейль-1 (IL-6, IL-18, IFN-y, IL-15, TNF-a, IL-1 a, IL-1p и IL-2) индуцирует ее. Это означает, что для клеточной гибели необходима синергическая передача цитокиновых сигналов. Чтобы идентифицировать цитокины, участвующие в этой синергии, были испытаны все возможные сочетания двух цитокинов. Из 28 испытанных пар только комбинация TNF-a и IFN-y вызывает гибель клеток в такой же степени, как коктейль-1. Обработка клеток коктейлем-2, в котором отсутствуют TNF-a и IFN-y, не приводит к аналогичным уровням их гибели. TNF-a и IFN-y могут синергически взаимодействовать с коктейлем-2, вызывая гибель клеток. Однако добавление TNF-a или IFN-y по отдельности к коктейлю-2 не приводило к гибели клеток, что дополнительно подтверждает, что синергия между TNF-a и IFN-y имеет решающее значение для индукции клеточной гибели. Комбинация TNF-a с IFN-a, IFN-в или IFN-X не вызвала высоких уровней гибели клеток, т.е. для координации с TNF-a важен сигналинг именно IFN типа II. Кинетика клеточной гибели, индуцированной костимуляцией TNF-a и IFN-y, пропорциональна их концентрациям. Комбинированная продукция TNF-a и IFN-y индуцирует гибель воспалительных клеток путем пироптоза, апоптоза и некроптоза. Сигнальная ось STAT1 (signal transducer and activator of transcription 1) / IRF1 (interferon regulatory factor), активированная совместным действием TNF-a и IFN-y, активирует экспрессию индуци-бельной нитрооксидсинтетазы iNOS (nitric oxide synthase 2, NOS2) и продукцию оксида азота (NO). Фармакологическая и генетическая делеция этого пути ингибирует пироптоз, апоптоз и некроптоз в макрофагах и защищает их от индуцированного TNF-a и IFN-y летального цитокинового шока.

Нейтрализация in vivo TNF-a и IFN-y в моделях заболеваний, связанных с цитокиновым штормом, обеспечивает существенную защиту от инфекции SARS-CoV-2, сепсиса и гемофагоцитарного лим-фогистиоцитоза. Блокада сигнального пути воспалительной гибели клеток, индуцированной вирусом SARS-CoV-2, может принести пользу пациентам с COVID-19 и синдромами, вызванными цитоки-новым штормом, за счет ограничения воспаления и повреждения тканей. Полученные данные представляют молекулярное описание термина «цито-киновый шторм» и открывают новые возможности для лечения других инфекционных, аутоиммунных и онкологических заболеваний, в которых синергия TNF-a и IFN-y играет ключевую патологическую роль. Эти данные получили экспериментальное подтверждение. В мышиной модели (TNF-a + IFN-y)-индуцированного шока, который имитирует симптомы COVID-19, введение не одного, а только комбинации TNF-a и IFN-y приводит к синергической смертности. У этих мышей отмечены усиленный приток воспалительных клеток в собственную пластинку кишечника и накопление нейтрофилов в капиллярах легкого. Комбинация TNF-a и IFN-y вызывает повреждение легких и кишечника, активируя медиаторы апоптоза в кишечных криптах и легких мышей. Клеточная гибель, опосредованная каспазой-8 и STAT1, является движущей силой летальности у мышей, подвергшихся (TNF-a + IFN-y)-индуцированному цитокиновому шоку. Подавление гибели воспалительных клеток, управляемой осью STAT1/каспаза-8, предотвращает (TNF-a + IFN-y)-опосредованную патологию и смерть in vivo. Мыши, которым инъецировали нейтрализующие антитела против TNF-a и IFN-y, на 100% защищены от смерти во время (TNF-a + IFN-у)-индуцированного шока, т.е. эти антитела эффективно нейтрализовали TNF-a и IFN-y in vivo в модели COVID-19 [60].

Одним из механизмов, связывающих цитокиновый шторм с повреждением органов, является гибель клеток путем пироптоза, апоптоза и некроптоза. Пироптоз осуществляется белками семейства гасдерминов через опосредованное каспаза-ми-1/4/5/8/11 расщепление порообразующей молекулы гасдермина D (GSDMD); или опосредованное гранзимом А расщепление гасдермина B (GSDMB). Апоптоз осуществляется каспазами-3/7 после активации инициаторных каспаз-8/9/10. Некроптоз осуществляется с помощью RIPK3(receptor-interacting serine/threonine protein kinаse)-опосредованной олигомеризации другой пороформирующей молекулы — MLKL (mixed lineage kinase domain-like), компонента «некросомы» (протеинового комплекса, который запускает индуцированную фактором TNF гибель клеток). Пироптоз и некроптоз идентифицированы как литические формы воспалительной гибели клеток, которые высвобождают цитокины и другие клеточные факторы, чтобы вызвать воспаление и предупредить иммунные клетки о патогенном или стерильном поражении, в то время как классический апоптоз исторически считается неиммуногенным, позволяющим клеточному содержимому поглощаться и повторно использоваться другими клетками. Однако в зависимости от стимула могут образовываться обширные перекрестные взаимодействия между пироптозом, апоптозом и некроптозом с общим названием «па-ноптоз» (PANoptosis), который является воспалительным по своей природе, поэтому определение природы гибели клеток, индуцированной комбинацией TNF-a и IFN-y, и использование генетических данных для анализа активированных сигнальных путей и молекулярных механизмов имеют важное значение для определения терапевтических мишеней. У пациентов с тяжелой формой COVID-19 и в макрофагах, обработанных in vitro TNF-a и IFN-y, активированы гены, кодирующие факторы IRF1, IRF5, IRF7, и сигнальная протеинкиназа JAK2 (Janus kinase 2). Известно, что киназа JAK2 передает сигнал транскрипционным факторам STAT1 и IRF1, активирующим транскрипцию IFN-y-индуцибельных генов. Макрофаги, лишенные STAT1 и IRF1, защищены от гибели, так как в них нарушены активация апоптозных каспаз-3/7/8, пироптозной молекулы GSDME, некроптозной молекулы MLKL, а также экспрессия iNOS и продукция NO [60].

R. Karki и соавт. [60] предложили новую парадигму для определения механизма цитокиново-го шторма. Среди цитокинов, индуцированных COVID-19, TNF-a и IFN-y играют ключевую роль в повреждении жизненно важных органов. Блокирование IL-6 дает неоднозначные клинические результаты; блокирование других цитокинов также может оказаться неэффективным. Хотя подавление клеточной гибели в контексте вирусной инфекции сопряжено с риском увеличения выхода вируса из инфицированных клеток, чрезмерная гибель клеток вносит больший вклад в патологию заболевания, чем титр вируса. Пиковые титры вируса SARS-CoV-2 в респираторных путях могут возникать еще до появления симптомов пневмонии. Исследование R. Karki и соавт. [60] очертило сигнальный путь, задействованный цитокинами TNF-a и IFN-y, выделив ряд дополнительных потенциальных терапевтических мишеней — проте-инкиназу JAK2 и ее эффекторы STAT1, IRF1, iNOS и NO. Таргетирование цитокинов — стимуляторов паноптоза вместе или по отдельности представляет собой самую непосредственную терапевтическую стратегию, так как антитела против TNF-a и IFN-y уже одобрены для клинического использования [60]. Например, эмапалумаб — антитело против IFN-y — одобрен FDA для лечения рефрактерного, рецидивирующего или прогрессирующего гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза, в котором решающую роль играет опосредованная комбинацией TNF-a и IFN-y патология [61]. В целом, идентификация этого критического пути (TNF-a + IFN-Y-индуцированной гибели воспалительных клеток обеспечивает множество лекарственных мишеней, которые можно исследовать на предмет эффективности их ингибирования при COVID-19, а также других инфекционных и воспалительных заболеваниях, которые включают в себя (TNF-a + IFN-у-индуцированный цитокиновый шторм, и служит основой для разработки научно обоснованных терапевтических стратегий для преодоления продолжающегося кризиса общественного здравоохранения [60].

Поскольку цитокиновый шторм многими авторами описывается как отличительный признак патологии COVID-19, продолжается ряд клинических испытаний для оценки эффективности цитокиновой блокады с использованием ингибиторов IL-6, IL-18, IL-1a и IL-ie [62-64]. Однако блокирование провоспалительных цитокинов, таких как TNF-a, IL-1 и IL-6, имеет неоднозначный успех в лечении заболеваний, связанных с цитокиновым штормом. Кроме того, некоторые авторы сомневаются, действительно ли явление, наблюдаемое при COVID-19, представляет собой цитокиновый шторм, поскольку уровни провоспалительных цитокинов у этих пациентов ниже, чем у пациентов с другими состояниями, связанными с цитокиновым штормом, например сепсисом [65, 66].

Описание цитокинового шторма у пациентов с COVID-19 побудило провести прямое сравнение COVID-19 с другими критическими заболеваниями, характеризующимися повышенными концентрациями цитокинов. M. Kox и соавт. [65] показали, что несмотря на наличие тяжелого легочного повреждения, цитокиновый шторм у пациентов с COVID-19 наблюдается не всегда. Уровни воспалительных цитокинов TNF, IL-6 и IL-8 у пациентов с COVID-19-ассоциированным ОРДС, находившихся в отделении интенсивной терапии и получавших искусственную вентиляцию легких (ИВЛ), значительно ниже, чем у пациентов с бактериальным септическим шоком и ОРДС [66]. В исследование D.E. Leisman и соавт. [66] были включены группы пациентов с COVID-19 (n=1245), а также состояниями, не связанными с COVID-19: с сепсисом (n=5320), синдромом высвобождения цитокинов (n=72) и ОРДС (n=2767). У пациентов с тяжелым или крайне тяжелым COVID-19 средняя концентрация IL-6 в сыворотке составляла 37 пг/мл, у пациентов с синдромом высвобождения цитокинов, не связанным с COVID-19, почти в 100 раз выше (3110 пг/мл, p <0,0001), у пациентов с сепсисом, не связанным с COVID-19, в 27 раз выше (984 пг/мл, p <0,0001) и у пациентов с ОРДС, не связанным с COVID-19, в 12 раз выше (460 пг/мл, p <0,0001). Эти данные ставят под сомнение роль цитокинового шторма в дисфункции органов, вызванной COVID-19. Они показывают, что цитокиновый шторм не описывает надлежащим образом среду, в которой возникает дисфункция органов, вызванная COVID-19. В отчетах о вскрытии неизменно отмечается широкое распространение SARS-CoV-2 в различных тканях. В этом контексте стоит учитывать, что лимфопения и преимущественно гипоиммунное состояние с последующим вирусным поражением тканей и дисрегулированным воспалением согласуется как с клиническими и патологическими отклонениями при COVID-19, так и с высокими концентрациями циркулирующих реагентов острой фазы [66].

Макрофаги представляют собой еще один источник цитокинового шторма. Системный цитокиновый профиль, наблюдаемый у пациентов с COVID-19, сравнили с синдромом активации макрофагов, который обычно характеризуется неконтролируемой активацией и размножением макрофагов [67]. Помимо резидентных макрофагов легких, в бронхоальвеолярной жидкости пациентов с тяжелой COVID-19 обнаружено множество провоспалительных макрофагов, повышенные уровни цитокинов IL-ie и IL-6, а также хемокиновых рецепторов, что указывает на привлечение воспалительных моноцитов и нейтрофилов [68]. Гиперактивация макрофагов ответственна за повышенную экспрессию «рецептора смерти» FAS (first apoptosis signal) на Т-клетках и тяжелую лимфопению, наблюдаемую более чем у 80% пациентов [69] и связанную с риском ОРДС [70]. К истощению Т-лимфоцитов и лимфопении приводит повышенная экспрессия белка PD-1 (programmed cell death protein 1) на Т-клетках у пациентов с COVID-19, свидетельствующая о количественном и функциональном (анергия) истощении Т-клеток и неэффективном иммунном контроле над репликацией вируса, которые способствуют прогрессированию заболевания [12, 46, 71]. Посмертное вскрытие пациентов с COVID-19 показало массивный апоптоз Т-клеток в лимфатических узлах и селезенке и отсутствие герминальных центров, необходимых для выработки долгосрочного иммунитета [69, 72, 73].

Протеомный анализ 17 фенотипически разнообразных клеточных линий, происходящих из легких, печени, кишечника, почек, сердца и мозга человека, выявил универсальное подавление сигналов интерферона после заражения SARS-CoV-2. Анализ сигнального пути JAK-STAT — ключевого компонента интерферонового ответа — в широком диапазоне клеточных систем обнаружил, что некоторые компоненты этого каскада атакованы вирусом SARS-CoV-2, что привело к десенсибилизации клеток к интерферону. Вирус SARS-CoV-2 быстро отключает его и тем самым подавляет иммунную защиту и снижает чувствительность клеток к лечению интерфероном. Исследование динамики изменений показало, что большинство компонентов каскада JAK-STAT истощились на ранней стадии заражения, что указывает на быстрое активное подавление их экспрессии в отличие от генерализованного ингибирования генов, наблюдаемого на поздних стадиях заражения. Эти данные раскрывают одну из стратегий иммунного уклонения SARS-CoV-2 и создания благоприятной среды для его репликации в различных типах тканей. Эти результаты показывают, что подавление сигналов интерферона является механизмом, широко используемым SARS-CoV-2 в различных тканях для уклонения от противовирусного врожденного иммунитета, и что таргетирование медиаторов уклонения вируса от иммунитета может блокировать его репликацию у пациентов с COVID-19. Кроме того, протеомный анализ выявил дифференциальную экспрессию около 5000 белков — сотен белков в каждой клеточной линии. Среди клеточных белков, экспрессия которых подавлена во всех клеточных линиях, протеинкиназа JAK1 (Janus kinase 1) — ключевая сигнальная молекула интерферонов и других цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6 и IL-7). Компоненты убиквитинового пути (SP22, UBL5, UBE2C), медиаторы воспаления (хемокины CXCL1, CXCL5, CXCL8 и CXCL12), белки-регуляторы клеточного цикла обнаружены среди белков с подавленной экспрессией. Экспрессия IFI35 — негативного регулятора противовирусных реакций — активируется вирусом SARS-CoV-2 [14].

Один из самых ранних и мощных иммунных ответов — сигналинг IFN — представляет непосредственную угрозу для вирусов и может быстро устранить их из инфицированных клеток. Взаимодействие IFN с его рецепторным комплексом и последующая активация рецепторассоциированных JAK-киназ активирует экспрессию транскрипционных факторов белков STAT. Вирус SARS-CoV-2 ингибирует экспрессию рецептора IFN и киназы JAK и снижает чувствительность инфицированных клеток к лечению IFN. Самый сильный дозозависимый эффект замечен в инфицированных клетках кишечника, где фосфорилирование STAT ингибируется более чем на 90%. Возрастающие дозы IFN вызывали усиление фосфорилирования STAT в неинфицированных клетках, а в инфицированных наблюдался только незначительный эффект. В клетках, инфицированных SARS-CoV-2, нарушена транслокация STAT из цитоплазмы в ядро и полностью заблокирована индукция интерферонсти-мулируемых генов (interferon-stimulated gene, ISG). Эти результаты показывают, что SARS-CoV-2 переводит инфицированные клетки в состояние, нечувствительное к интерферону [14].

Врожденные ошибки в передаче сигналов IFN и наличие аутоантител к IFN предрасполагают к тяжелому течению COVID-19 [74, 75]. SARS-CoV-2 обладает набором механизмов противодействия эффекторным функциям интерферона — ингибированию передачи сигналов IFN, экспрессии вирусных сенсоров и других сигнальных молекул. Общий результат этого ингибирования — непрерывное распространение вируса в разных тканях. D.Y. Chen и соавт. [14] показали, что к тому времени, когда пациент с COVID-19 получает IFN, большое количество клеток инфицировано вирусом, и лечение интерфероном может не дать эффекта, поэтому время начала терапии IFN будет ключевым фактором, определяющим результат. Раннее использование IFN является защитным, тогда как его позднее введение ассоциировано с замедленным выздоровлением и повышенной смертностью [76]. Масштабное клиническое исследование SOLIDARITY, проводимое Всемирной организацией здравоохранения в 30 странах, не показало защитного эффекта IFN у госпитализированных пациентов с поздней стадией COVID-19 [77].

Следует отметить, что активация пути JAK-STAT стимулирует выработку IL-6 и других воспалительных цитокинов, которые привлекают иммунные клетки к месту инфекции, чтобы уничтожить инфицированные клетки. Ингибирование оси JAK-STAT вирусом SARS-CoV-2 подавляет выработку цитокинов, тем самым нарушая своевременный воспалительный ответ. Сигналинг IFN участвует во взаимодействии между врожденным и адаптивным иммунитетом. Потеря связи между этими двумя ветвями иммунитета вызывает тяжелое заболевание у пациентов с COVID-19 [78, 79]. Исследование, в котором изучали периферическую кровь пациентов с COVID-19 разной степени тяжести, также показало сильную корреляцию между нарушением ответа на IFN и клиническим исходом инфекции [56]. Это исследование раскрывает феномен индуцированной вирусом SARS-CoV-2 десенсибилизации к IFN как основу патогенеза COVID-19 и подавления врожденного и адаптивного иммунитета.

Экспрессия ACE2 в лимфоцитах превращает их в потенциальные мишени для SARS-CoV-2, что приводит к гибели Т-клеток CD4+ и CD8+, дисбалансу как врожденных, так и адаптивных иммунных ответов, гиперактивации нейтрофилов и макрофагов и отсроченному клиренсу вируса. В контексте COVID-19-ассоциированной лимфопении наблюдаются (1) гибель инфицированных лимфоцитов и (2) разрушение вирусом лимфатических органов. Посмертный анализ лимфатических узлов и селезенки подтвердил апоптоз лимфоцитов и макрофагов CD169+ у пациентов с COVID-19 [3]. Воспаление может усиливать экспрессию ACE2 на макрофагах [48], увеличивая их восприимчивость к вирусу. Установлена роль макрофагов CD169+, которые содержат вирусный нуклеокапсидный белок, в качестве медиаторов гибели активированных лимфоцитов [12]. Несмотря на абсолютное сокращение общего количества Т-лимфоцитов, включая Т-клетки CD4+ и CD8+, основное сокращение наблюдается среди Т-хелперов памяти и регуляторных клеток, в то время как количество наивных Т-клеток и Th17 даже увеличивается [73, 80, 81]. На фоне уменьшения абсолютного количества Т-лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов при тяжелой и крайне тяжелой COVID-19 усиливается нейтрофильный ответ, что приводит к увеличению соотношения нейтрофилов и лимфоцитов [80].

Чтобы получить целостное представление о различиях между тяжелой и легкой патологией COVID-19 и интегрировать вклады всех основных типов иммунных клеток, включая нейтрофилы, моноциты, тромбоциты, лимфоциты, а также сыворотки, A.J. Combes и соавт. [82] выполнили анализ отдельных клеток цельной крови. Секвенирование РНК единичных лейкоцитов подтвердило положительную связь между количеством нейтрофилов и тяжестью заболевания и обратную корреляцию для лимфоидных популяций. Пациенты с легкой формой заболевания COVID-19 демонстрируют скоординированный паттерн экспрессии ISG во всех клеточных популяциях, и эти клетки системно отсутствуют у пациентов с тяжелым заболеванием. Среди нейтрофилов идентифицирована популяция ISG-экспрессирующих клеток, количество которых существенно различается у пациентов с легкой/умеренной и тяжелой формой COVID-19. Генная сигнатура ISG включает в себя гены, кодирующие главные антивирусные регуляторы ISG15 и IFITM3 (IFN-inducible transmembrane protein 3), которые ограничивают проникновение вируса в цитозоль.

Среди мононуклеарных фагоцитов (моноциты, макрофаги, дендритные клетки и плазмацитоидные дендритные клетки) выявлены 7 кластеров транскрипционно различных субпопуляций с гетерогенным количеством ISG и уникальными молекулярными идентификаторами для каждого кластера. Популяции классических ISG-экспрессирующих моноцитов и нейтрофилов идентифицированы как обогащенные у пациентов с COVID-19 легкой и средней степени тяжести. Количество плазмацитоидных дендритных клеток, которые являются продуцентами интерферона IFN-a, также обычно увеличено у этих пациентов, хотя статистически незначимо. Экспрессия моноцитами ISG+ генов, связанных с гликолизом и окислительным фосфорилированием, свидетельствует о наличии бактериального сепсиса. Анализ дифференциальной экспрессии генов продемонстрировал, что ISG являются доминирующими генами, ассоциированными с легким и умеренным фенотипом COVID-19. У всех пациентов с легкой/умеренной степенью тяжести COVID-19 отмечена корреляция частоты ISG-экспрессирующих клеток (моноцитов, нейтрофилов, Т- и В-лимфоцитов). Для пациентов с тяжелым течением COVID-19 характерно высокое соотношение субпопуляций нейтрофилов S100A12+ к нейтрофилам ISG+ [82].

Сравнение цитокиновых ответов, вызванных вирусами H5N1, H7N9, SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-CoV-2, обнаруживает специфическую для SARS-CoV-2 дисрегуляцию ответа IFN типа I и его цитокиновых сигнатур. Инфекция вирусов гриппа H5N1 и H7N9, коронавирусов SARS-CoV и MERS-CoV вызывает раннюю индукцию IFN типа I, тогда как ответ IFN типа I на инфекцию SARS-CoV-2 проявляется слабо, если вообще проявляется [83]. Исследование уровней IFN-a в сыворотке обнаружило, что у лиц с легкой/умеренной формой инфекции продукция этого цитокина в среднем больше, чем у пациентов с тяжелой формой, что согласуется с более высокой численностью популяций клеток ISG+, хотя некоторые пациенты с тяжелым заболеванием продуцируют высокие уровни IFN-a. Популяции клеток, экспрессирующих ISG, ассоциированы с легкой формой COVID-19, более низкими уровнями белка сурфактанта SP-D (индикатор повреждения альвеолярного эпителия) в плазме и лишь незначительно — с уровнями IL-6. Кластеризация большинства клеточных субпопуляций ISG+ положительно коррелирует с множеством факторов, указывающих на сильный ответ Th1 и ISG (CXCL1/6/10/11, TNF-в, IL-12B, MCP-2/4), и негативно — с другими (CCL23, MMP10, HGF). Неожиданным антикоррелятом состояния стала концентрация сывороточных антител против белков SARS-CoV-2 Spike и Nucleocapsid. Эта антикорреляция была глубокой, и авторы сочли парадоксальным, что тяжелобольные пациенты имеют более высокие уровни потенциально нейтрализующих антител. Это явно противоречит тому, что вирусная нагрузка связана с тяжестью и смертностью при COVID-19. Поскольку высокие титры антител и снижение вирусной нагрузки являются признаком более поздних стадий заболевания, выдвинута гипотеза о том, что в этих случаях легкое/умеренное течение заболевания, характеризуемое высокой частотой сигнатур ISG, предшествует тяжелой стадии болезни. Однако титры антител у пациентов с тяжелой формой заболевания стабильно выше по сравнению с легкой/ средней степенью тяжести даже через 2 недели после появления симптомов, и только у 10% пациентов с легкой/средней COVID-19 может развиться тяжелое заболевание. Более того, отсутствует статистическая корреляция между числом дней от начала заболевания и наличием популяций клеток ISG+, что свидетельствует против простой временной зависимости между легким/умеренным и тяжелым состоянием [82].

Нарушение иммунной толерантности

Исследование сыворотки тяжелых пациентов демонстрирует, что они продуцируют антитела с множеством типов специфичности против ин-терферонстимулированных клеток, и что эти антитела функционально блокируют образование ISG-экспрессирующих клеток, ассоциированных с легкой формой заболевания. Чрезмерный гуморальный ответ и продукция аутоантител (ауто-АТ) настраивают иммунную систему против самой себя у многих пациентов с COVID-19, и это определяет мишени для иммунотерапии, позволяющей иммунной системе обеспечить противовирусную защиту. Фенотипические различия двух групп пациентов с различной степенью тяжести COVID-19 могут отражать или зависеть от системных факторов, влияющих на все клеточные популяции. Оказалось, что сыворотка 10% пациентов содержит антитела против IFN-a [82], что согласуется с результатами исследования P. Bastard и соавт. [74], в котором они также обнаружены у 10,2% пациентов с COVID-19. Люди, у которых отсутствуют определенные интерфероны, более восприимчивы к инфекционным заболеваниям. Система аутоантител подавляет ответ IFN, чтобы предотвратить повреждение от воспаления, вызванного патогенами. У 10,2% (101 из 987) пациентов с угрожающей жизни COVID-19 — в 30 раз больше, чем в общей популяции, — в начале тяжелого течения заболевания имелись высокие титры нейтрализующих ауто-IgG против IFN-w (13 пациентов), против 13 типов IFN-a (IFN-a1, a2, a4, a5, a6, a7, a8, a10, a13, a14, a16, a17, a21; 36 пациентов) и против обоих интерферонов (IFN-a и IFN-w; 52 пациента), 19 из них имели ауто-АТ против IFN-в. Эти ауто-АТ нейтрализуют высокие концентрации соответствующих интерферонов типа I и их способность блокировать инфекцию SARS-CoV-2 in vitro. До пандемии они присутствовали только у 4 из 1227 (0,33%) здоровых людей. Эти ауто-АТ не обнаружены у людей с бессимптомной или легкой инфекцией SARS-CoV-2 (р <10^-16); 1,5% пациентов с тяжелой COVID-19 и аутоантителами против IFN типа I также имели ауто-АТ против других цитокинов (IFN-y, GM-CSF , IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-22, IL-17A, IL-17F и/или TNFP), при этом 95 (94%) пациентов с жизнеугрожающей пневмонией из 101 пациента с ауто-АТ были мужчинами. Все протестированные пациенты имели низкие или неопределимые уровни IFN-a в сыворотке во время острой фазы заболевания. В-клеточная аутоиммунная фенокопия врожденных дефектов IFN типа I является причиной жизнеугрожающей COVID-19-ассоциированной пневмонии как минимум у 2,6% женщин и 12,5% мужчин; 49,5% пациентов с ауто-АТ были старше 65 лет по сравнению с 38% пациентов без ауто-АТ, т.е. частота циркулирующих ауто-АТ против IFN типа I увеличивается с возрастом. Уникальный возрастной профиль является одной из особенностей COVID-19, при которой смертность увеличивается вдвое каждые 10 лет после 50 лет жизни [5]. Эти данные отчасти объясняют преобладание мужчин среди пациентов с жизнеугрожающей COVID-19 и увеличение риска с возрастом и открывают путь для профилактики и лечения тяжелой COVID-19, включая плазмаферез, деплецию плазмобластов и введение рекомбинантных IFN типа I, не связывающихся аутоантителами (например, IFN—в) [74].

Ответ ауто-АТ проявляется у всех тяжелых пациентов и нацелен на популяции клеток ISG+ и их генерацию. Антитела у многих из этих пациентов обладают прямой специфичностью к детерминантам на поверхности ISG-экспрессирующих моноцитов. Как и почему в ходе инфекции SARS-CoV-2 нарушается толерантность к ISG, еще предстоит определить. Одним из кандидатов на роль модулятора В-клеточного ответа является прямое инфицирование моноцитов вирусом SARS-CoV-2. Если при раннем иммунном ответе белки ISG презентируются вместе с белками патогена, толерантность иммунной системы к белкам ISG может быть нарушена. И наоборот, инфицирование моноцитов вирусом может вызывать чрезмерные реакции В-клеток на многие антигены, а не только на те, которые образуются во время инфекции. Таргетирование чрезмерно многочисленных и аутореактивных В-клеток с помощью таких препаратов, как ритук-симаб, вероятно, может преодолеть глобальное подавление защитного ISG-опосредованного противовирусного иммунитета. Наличие циркулирующих нейтрализующих ауто-АТ против IFN-a тесно связано с низкими уровнями IFN-a в сыворотке. Плазма пациентов с нейтрализующими ауто-АТ против IFN типа I нейтрализует способность IFN-a2 блокировать инфицирование клеток SARS-CoV-2 in vitro и in vivo, в отличие от плазмы здоровых людей и пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, без ауто-АТ [74]. Подобный блок генерации сигнатуры ISG в ответ на IFN-a наблюдался в разных клеточных популяциях, включая лимфоциты [82]. Эти данные свидетельствуют о том, что в крови пациентов содержится достаточно большое количество ауто-АТ, чтобы нейтрализовать соответствующие IFN типа I и блокировать их противовирусную активность против SARS-CoV-2. Относительно некоторых пациентов с нейтрализующими ауто-АТ против IFN типа I известно, что эти антитела присутствовали у них до пандемии, следовательно, они являются причиной, а не следствием тяжелой инфекции SARS-CoV-2. Эти результаты имеют прямое клиническое значение. Во-первых, пациенты, инфицированные SARS-CoV-2, могут быть обследованы на наличие ауто-АТ для выявления лиц, подверженных риску развития опасной для жизни пневмонии. Во-вторых, такие пациенты, выздоравливающие после тяжелой COVID-19, должны быть исключены из донорства рекон-валесцентной плазмы [74]. Удаление этих ауто-АТ восстанавливает индукцию экспресии IFITM3 и общий выход интерферон-индуцированных моноцитов [82].

Как выяснилось, аутоантитела имеются у 6080% госпитализированных больных COVID-19, особенно распространены антицитокиновые ауто-АТ, часто сразу к нескольким цитокинам, с большим количеством различных специфичностей, генерируемых у отдельных пациентов. У редких пациентов выявлены антитела IgG к АСЕ2. Некоторые виды аутоантител появились de novo после инфекции SARS-CoV-2. Авторы пришли к выводу, что SARS-CoV-2 вызывает развитие новых аутоантител IgG у значительной части госпитализированных пациентов с COVID-19 и что тяжелая форма COVID-19 может нарушить аутотолерантность. Один из самых важных вопросов, на которые нет ответа, — что приводит к потере толерантности и развитию аутоиммунитета у пациентов с COVID-19 и почему таргетируются определенные молекулы. Изучение этих механизмов продолжается [84].

КЛИНИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНФЕКЦИИ SARS-COV-2

Инфекция SARS-CoV-2 приводит к широкому спектру клинических проявлений — от бессимптомных случаев до быстрого летального исхода. Тяжесть инфекции SARS-CoV-2 связана с нарушением регуляции иммунных реакций [18]. В начале эпидемии наиболее распространенными симптомами были одышка (более чем у 50% всех пациентов с COVID-19 [85, 86]), лихорадка и кашель, но теперь появляются новые особенности, вызванные самой вирусной инфекцией или ее последствиями [87]. Воспаление первоначально запускается в легких повреждением альвеолярных эпителиальных клеток, вызванным SARS-CoV-2, что вызывает обширную инфильтрацию иммунных клеток. Этот местный воспалительный ответ вызывает синдром высвобождения цитокинов, известный как цито-киновый шторм, что приводит к гипервоспалению многих органов с последующим повреждением тканей и смерти пациентов [88]. Другие патофизиологические механизмы, такие как эндотелиоз, нарушение регуляции РААС, тромбоз, лимфоцитопе-ния, анергия Т-клеток, также могут способствовать заболеваемости [89, 90]. До 94% всех пациентов с COVID-19 имеют одно или несколько хронических (сопутствующих) заболеваний, из них наиболее частые — гипертония, хроническая обструктивная болезнь легких, диабет, сердечно-сосудистые и цереброваскулярные патологии [91].

Гипогемоглобинемия, повреждение эндотелиального гликокаликса

При COVID-19 инфекция SARS-CoV-2 снижает концентрацию гемоглобина в крови и нарушает процесс транспорта кислорода гемоглобином, вызывая у больных кислородную недостаточность [92]. По данным W. Liu и H. Li [93], коронавирус атакует 1-бета-цепь гемоглобина, высвобождая из него ионы железа с образованием порфирина, так что все меньше и меньше гемоглобина будет доступно для газообмена. Кроме того, ионы железа (Fe2+ или Fe3+), входящие в структуру оксигемоглобина, в свободном состоянии токсичны и увеличивают окислительный стресс крови. Когда SARS-CoV-2 разрушает гемоглобин, эти ионы попадают в кровь и ткани, где и начинаются основные эффекты вируса, снижается оксигенация и увеличивается гипоксия, что может объяснить одышку и усталость у некоторых пациентов после выздоровления, хотя их легкие были полностью очищены от вируса [94, 95]. О разрушении гемоглобина свидетельствует повышение сывороточных уровней ферритина, С-реактивного белка, лактатдегидрогеназы и скорости оседания эритроцитов [93]. Низкая сатурация даже при ИВЛ является дополнительным доказательством. Таким пациентам может потребоваться регулярное переливание крови или сыворотки крови при поддержке с помощью гипербарического кислорода [96]. Разрушение гемоглобина нарушает доставку кислорода к жизненно важным органам. Учитывая, что анемия относительно распространена у людей старше 60 лет, дальнейшее снижение оксигенации органов может отчасти объяснить повышенную смертность пожилых пациентов. Связывание вируса с гемоглобином приводит к высвобождению свободных радикалов и дальнейшей гипоксии и может вызвать сердечный приступ или остановку сердца [93]. В основе всего этого лежит повреждение эндотелиального гликокаликса из-за связывания сывороточного альбумина вирионом SARS-CoV-2. Низкий уровень альбумина был у 80% умерших пациентов с COVID-19 [5].

Сепсис и септический шок

Некоторые пациенты с COVID-19 выздоравливают без дополнительной поддержки, кроме кислородной. Состояние других внезапно ухудшается с развитием ОРДС, который возникает при скоплении жидкости в альвеолах и ассоциирован с сепсисом [96]. Уровень кислорода в их крови резко падает, развивается одышка [97]. На изображениях компьютерной томографии в легких таких пациентов выявляется «матовое стекло». Обычно им требуется ИВЛ, и смертность среди них высока. Вскрытие показало, что альвеолы заполнены жидкостью, эукариотическим материалом и мертвой тканью легких [98]. Наряду с этой патологией, органная недостаточность почечной, печеночной и сердечно-сосудистой систем ускоряется сепсисом капиллярной сети. Тромбоз, полиорганная недостаточность и симптомы сепсиса позволяют диагностировать системный септический шок почти во всех случаях смерти. Механизм развития сепсиса является системным и проявляется синдромом повышенной проницаемости капилляров, окружающих альвеолы легких, и капилляров всех других органов. Эпителий выстлан гелеобразным слоем из взаимосвязанных белков — эндотелиальным гликокаликсом, что необходимо для поддержания капиллярной микроциркуляции, адсорбции и реабсорбции через капиллярные мембраны и распределения жидкости по тканям. Разрушение этого слоя приводит к сепсису и септическому шоку. Повреждение эндотелиального гликокаликс можно ограничить, поддерживая физиологическую концентрацию белка плазмы, особенно альбумина. Сывороточный альбумин транспортирует гормоны, свободные жирные кислоты и поддерживает онкотическое давление, но вирионы SARS-CoV-2 конкурентно связываются с альбумином, что нарушает его транспортную функцию и образование эндотелиального гликокаликса [5].

Гипоальбуминемия часто наблюдается у пациентов с такими состояниями, как диабет, гипертония и хроническая сердечная недостаточность, т.е. у тех, кто наиболее уязвим для инфекции SARS-CoV-2. Гипоальбуминемия, коагулопатия и сосудистые заболевания связаны при COVID-19 и позволяют прогнозировать исход независимо от возраста. Гипоальбуминемия также является известным фактором сепсиса и ОРДС, когда жидкость накапливается в альвеолах. По мере распространения вирусных частиц соотношение между связанным и несвязанным альбумином увеличивается. Уменьшение количества питательных веществ провоцирует клеточный стресс и апоптоз. Таким образом, толерантность к вирусу зависит от транспорта нутриентов и количества свободного альбумина. Терапия альбумином для замены связанного альбумина и увеличения его общей концентрации в плазме и интерстициальной жидкости может облегчить системный сепсис и предотвратить смерть. При септическом шоке повреждение эндотелиального гликокаликса может вызвать воспаление эндотелия сосудов и неравномерное распределение микрососудистого кровотока, а также высвобождение оксида азота, который в норме участвует в регуляции сосудистого гомеостаза, но его неконтролируемое высвобождение ведет к повреждению эритроцитов и уменьшает способность крови переносить кислород [92].

Коинфекционные осложнения

Снижение эффекторной функции и числа клеток, участвующих в клиренсе патогенов, увеличивает риск коинфекции с другими вирусами, бактериями и грибками, особенно в случае длительной госпитализации пациентов с COVID-19. Уровень прокальцитонина, который считается маркером тяжелых бактериальных инфекций, не повышается у пациентов с неосложненной COVID-19 при поступлении, но его прогрессирующее повышение связано почти с 5-кратным повышением риска тяжелого течения заболевания [99]. Частота вторичной бактериальной или грибковой инфекции значительно повышена у пациентов с тяжелой формой COVID-19, общая частота коинфекции у больных COVID-19 оценивается в 8% [100]. Бактериемия выявлена у 12% пациентов, получавших инвазивную ИВЛ, и менее чем у 2% остальных пациентов [101]. Эти исследования, вероятно, недооценивают фактическую частоту коинфекции в данной популяции. Установлено, что 21% пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, имеют и другой респираторный патоген, включая риновирус/энтеровирус и респираторно-синцитиальный вирус [102].

Еще одна особенность тяжелого течения COVID-19 связана с циркулирующей митохондриальной ДНК (МТ-ДНК), выделяемой поврежденными клетками солидных органов и вызывающей воспаление. Количественная оценка содержания циркулирующей MT-ДНК в проспективно собранных образцах бесклеточной плазмы больных COVID-19 на момент обращения в больницу выявила ее резкое увеличение у пациентов, госпитализированных в отделения интенсивной терапии, которые в конечном итоге умерли. Многофакторный регрессионный анализ показал, что высокие уровни циркулирующей МТ-ДНК являются независимым фактором риска и ранним индикатором летальных исходов после поправки на возраст, пол и сопутствующие заболевания, столь же надежным как клинически установленные показатели системного воспаления [103].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У большинства пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, симптомы отсутствуют, или у них развиваются легкие или умеренные симптомы, и они выздоравливают через 1-2 недели. Однако приблизительно у 20% пациентов развивается пневмония, а 5% пациентов с тяжелой дыхательной недостаточностью нуждаются в искусственной вентиляции легких и попадают в отделения интенсивной терапии.

До сих пор не существует специфической терапии COVID-19. Одним из факторов, определяющих отсутствие эффективных методов лечения и лекарств, является неизученность патофизиологии COVID-19. Изучение сложной связи между различными системами протеолитической защиты, действующими в сосудистой сети человека при COVID-19, и роли вовлеченных в нее медиаторов откроет возможности их фармакологической модуляции.

В этом обзоре мы стремились осветить механизмы иммуновоспалительных, тромбогемостатических и других проявленний COVID-19. Уровни воспалительных биомаркеров и биомаркеров коагуляции значительно различаются у пациентов с COVID-19, что свидетельствует о существовании различных биохимических/клинических фенотипов, в которых преобладают различные клеточные системы. Разработка новых лекарств для лечения этого заболевания требует знания молекулярных путей его развития и критически важных молекул-мишеней. Блокирование путей проникновения вируса, включая рецепторы и ферменты, и контроль иммунных ответов — перспективные стратегии для уменьшения полиорганной дисфункции.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Щербак С.Г, Голота А.С. — написание текста статьи; Шнейдер О.В., Вологжанин Д.А. — написание и редактирование текста статьи; Камилова Т.А. — поисково-аналитическая работа, обсуждение и редактирование текста статьи. Авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Author contribution. Golota A.S., Shcher-bak S.G. — writing of the article; Shneider O.V., Vologzhanin D.A. — revision and writing of the article; Kamilova T.A. — search and analytical work, revision of the article. The authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

About the authors

Alexander S. Golota

Saint-Petersburg City Hospital No 40 of Kurortny District

Author for correspondence.
Email: golotaa@yahoo.com
ORCID iD: 0000-0002-5632-3963
SPIN-code: 7234-7870

MD, Cand. Sci. (Med.), Associate Professor

Russian Federation, 9B Borisova st., 197706, Saint Petersburg, Sestroretsk

Tatyana A. Kamilova

Saint-Petersburg City Hospital No 40 of Kurortny District

Email: kamilovaspb@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6360-132X
SPIN-code: 2922-4404

Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, 9B Borisova st., 197706, Saint Petersburg, Sestroretsk

Olga V. Shneider

Saint-Petersburg City Hospital No 40 of Kurortny District

Email: o.shneider@gb40.ru
ORCID iD: 0000-0001-8341-2454
SPIN-code: 8405-1051

MD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, 9B Borisova st., 197706, Saint Petersburg, Sestroretsk

Dmitry A. Vologzhanin

Saint-Petersburg City Hospital No 40 of Kurortny District; Saint-Petersburg State University

Email: volog@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-1176-794X
SPIN-code: 7922-7302

MD, Dr. Sci. (Med.)

Russian Federation, 9B Borisova st., 197706, Saint Petersburg, Sestroretsk; 7-9, Universitetskaya nab., St. Petersburg, 199034

Sergey G. Sherbak

Saint-Petersburg City Hospital No 40 of Kurortny District; Saint-Petersburg State University

Email: b40@zdrav.spb.ru
ORCID iD: 0000-0001-5047-2792
SPIN-code: 1537-9822

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor

Russian Federation, 9B Borisova st., 197706, Saint Petersburg, Sestroretsk; 7-9, Universitetskaya nab., St. Petersburg, 199034

References

Supplementary files