COVID-19 сопровождается развитием широкого спектра поражений сердечно-сосудистой системы. Клинические данные подтверждают возникновение у ряда пациентов с новой коронавирусной инфекцией инфарктов миокарда, острого коронарного синдрома, миокардитов, внезапной сердечной смерти [1—5]. У 19% пациентов, госпитализируемых с COVID-19, наблюдаются такие симптомы поражения сердца, как боли за грудиной, гипотензия, аритмии, признаки сердечной недостаточности. Хотя наиболее частой причиной смерти при COVID-19 является дыхательная недостаточность, однако сердечно-сосудистая недостаточность также вносит свой вклад в общую смертность [2, 6—8]. S. Shi и соавт. [2] при анализе причин смерти при новой коронавирусной инфекции обнаружили, что в 51% случаев смерть наступала от сердечных приступов. Q. Ruan и соавт. [9] при ретроспективном изучении историй болезни выявили, что из 68 умерших с подтвержденной коронавирусной инфекцией у 5 (7%) смерть наступила от сердечно-сосудистой недостаточности, у 22 (33%) — от легочно-сердечной недостаточности, у них при жизни фиксировали высокие уровни тропонина и миоглобина в сыворотке крови. Авторы высказывают предположение, что причиной летального исхода послужил фульминантный миокардит, однако данных аутопсии не приводится.
В литературе описаны разнообразные виды патологии миокарда при COVID-19 [10, 11]:
1) прямое повреждение миокарда вследствие взаимодействия вируса с АПФ-2 кардиомиоцитов [4];
2) ишемическое повреждение миокарда в результате нарастающей гипоксии в крови из-за респираторного дистресс-синдрома, а также на фоне атеросклеротических изменений коронарных артерий, коронариита, эндотелиальной дисфункции, вазоконстрикции и коагулопатии [12];
3) миокардит, развивающийся в результате прямого вирусного повреждения миокарда, ишемического и цитокинового повреждения миокарда, которое может возникать из-за системной инфекции и «цитокинового шторма» [13, 14];
4) апоптотические изменения, вероятнее всего, связанные с 3CLpro — ингибитором аминопептидаз, влияющих на активность клеточных протеасом [15].
В литературе приводится крайне мало случаев описания миокардита у пациентов с COVID-19 с анализом биопсийного и аутопсийного материала. Отдельными авторами сообщается о нескольких случаях клинически диагностированного миокардита без гистологического подтверждения [3, 16—18]. Указывается случай посмертной диагностики лимфоцитарного миокардита с гистологическим подтверждением у пациента из Италии [19]. Одними из первых сообщили о наличии лимфоцитарных миокардитов при COVID-19, установленных морфологически, российские авторы в июне—июле 2020 г. [14, 20]. Вскоре появились описания SARS-CoV-2-позитивного миокардита группой авторов из клиники Шарите [21]. В первой из этих работ методом ПЦР была впервые обнаружена РНК вируса в прижизненных биоптатах правого желудочка — вирус наряду с признаками миокардита выявлен у 5 из 104 больных, которым биопсия была выполнена по поводу сердечной недостаточности неясного генеза [21]. Возможность РНК-позитивного миокардита показана у больных с отрицательными мазками из зева [22]. Позднее геном SARS-CoV-2 был ретроспективно идентифицирован в биоптатах правого желудочка от 29.02.20, симптоматика миокардита развилась незадолго до этого и регрессировала после иммуносупрессивной терапии в последующие 2 мес [23].
Следует отметить, что ни в одном из упомянутых клинических описаний уровень антикардиальных антител в крови не изучался, что не позволяет оценить вклад иммунных механизмов в формирование представленной клинической картины. Работы по изучению уровня и роли антикардиальных антител при COVID-19 и в постковидный период до сих пор отсутствуют в доступной медицинской литературе. Специальное исследование было проведено лишь в COVID-госпитале Сеченовского Университета: повышение титра антител к тем или иным антигенам сердца выявлено почти у ¾ больных с острой коронавирусной инфекцией и коррелировало не только с кардиальными симптомами (аритмиями, перикардитом), но и с тяжестью пневмонии, маркерами воспаления и прогнозом [24].
В связи с тем, что случаев миокардита, ассоциированного с COVID-19, в литературе описано крайне мало, приводим данные собственного исследования.
Цель исследования — изучить клинико-морфологические особенности SARS-CoV-2-ассоциированного миокардита с определением наличия РНК и белков вируса в ткани миокарда.
Материал и методы
Исследование выполнено на материале 32 аутопсий пациентов, умерших от тяжелой формы новой коронавирусной инфекции, сопровождавшейся развитием миокардита. Исследовали макро- и микропрепараты сердца. Кусочки миокарда вырезали из свободной стенки правого и левого желудочков, межжелудочковой перегородки, стенок правого и левого предсердия (5—7 образцов). Серийные парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином, толуидиновым синим и по Ван-Гизону. Проводили иммуногистохимическое (ИГХ) исследование иммунопероксидазным методом с использованием панели антител для характеристики клеточного состава инфильтрата и детекции белков вируса (табл. 1). Ставили положительные и отрицательные контрольные реакции. В качестве позитивного контроля использовали блоки из клеток 293Т со spike-белком и белком нуклеокапсида вируса SARS-CoV-2 (cell pellet block — GeneTex435640, GeneTex435641); в качестве негативного контроля — аутопсийный материал миокарда пациентов без миокардита и без COVID-19 и миокарда пациентов с COVID-19, но без миокардита. Согласно международным критериям Далласа, а также рекомендациям Европейского общества кардиологов и Европейского общества патологов, диагноз вирусного лимфоцитарного миокардита ставился при наличии в миокарде на 1 мм2 не менее 7 CD3+ лимфоцитов и не менее 14 CD45+ лимфоцитов.
Таблица 1. Панель первичных антител для ИГХ-исследования миокарда пациентов с COVID-19
| Первичные антитела, производитель | Клон, разведение | Назначение первичных антител |
| CD3, «Cell Marque» | MRQ-39, 1:1000 | Пан-T-лимфоцитарный маркер реагирует с антигеном, присутствующим на поверхности и в цитоплазме T-лимфоцитов |
| CD20, «Cell Marque», кроличьи моноклональные | SP32, 1:500 | Трансмембранный белок в поздних предшественниках B-клеток и зрелых B-клетках, который играет роль в регулировании пролиферации и дифференциации |
| CD45, «Dako», мышиные моноклональные | 4KB5, 1:100 | Мембранный гликопротеин, общий лейкоцитарный антиген. Экспрессируется на различных типах лимфоцитов |
| CD68, «Dako», мышиные моноклональные | KP1, 1:50 | Гликопротеин, экспрессируется на поверхности моноцитов и макрофагов |
| Nucleocapsid antibody SARS-CoV-2, «GeneTex», кроличьи поликлональные | 1:500 | Белок нуклеокапсида коронавируса (COVID-19) |
| Spike antibody SARS-CoV-2, «GeneTex», кроличьи поликлональные | 1:500 | Spike-белок коронавируса (COVID-19) |
Обнаружение вирусной РНК в образцах проводили с помощью ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР). Для выделения тотальной РНК из тканей, фиксированных в парафине, применяли RNeasy FFPE Kit («Qiagen, Hilden», Германия). РВ-ПЦР для SARS-CoV-2 выполняли с помощью набора N2, как описано в литературе [25]. Для проведения анализа использовали 20 мкл реакционной смеси, состоящей из 2 × Master Mix и RT из набора QuantiTect probe RT-PCR («Qiagen, Hilden», Германия), набор праймеров/зондов N2 (праймер NIID_2019-nCoV_N_F2, праймер NIID_2019-nCoV_N_R2 и зонд NIID_2019-nCoV_N_P2) и 5 мкл РНК, экстрагированной из образцов тканей, фиксированных в парафине, подвергали ПЦР в амплификаторе QuantStudio 5 («Thermo Scientific», США). Условия реакции были следующими: 50 °C в течение 30 мин, 95 °C —15 мин и 45 циклов 95 °C в течение 15 с и 60 °C — 1 мин. Для всех образцов, положительных по РВ-ПЦР, получены значения Ct. Значения Ct образцов сравнивали с таковыми Ct контрольных позитивных и негативных образцов (рис. 1).
Рис. 1. ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (РТ-ПЦР).
Результаты исследования
1. Клиническая характеристика
Средний возраст пациентов составил 72,7±15,5 года. В группе преобладали (53%) лица мужского пола.
Основными клиническими проявлениями ковидного миокардита являются, по нашим наблюдениям, бивентрикулярная сердечная недостаточность (с/без дилатации и падением сократимости как левого, так и правого желудочка) и/или разнообразные нарушения ритма — от частой политопной экстрасистолии до непрерывно рецидивирующей мерцательной аритмии и желудочковой тахикардии. Раннее и выраженное поражение миокарда правого желудочка (вследствие его перегрузки в рамках легочной гипертензии, прямой тропности вируса к правым отделам сердца?) следует, вероятно, считать одной из характерных особенностей болезни. Средние и высокие уровни антикардиальных антител характерны для абсолютного большинства таких больных, тогда как общевоспалительные маркеры в крови практически никогда не превышают нормы.
2. Морфологическая характеристика
При макроскопическом исследовании средние размеры сердца составили 14,2×10,5×6,5 см. Масса сердца колебалась от 300 до 430 г, в среднем составляя 362±37 г. Толщина стенки левого желудочка в среднем 2,2—2,7 см, правого — 0,3—0,5 см. При вскрытии в 68% наблюдений отмечались дилатация камер и гипертрофия стенки левого желудочка сердца. На эндокарде в 9 (31%) случаях наблюдались пристеночные тромбы. Миокард дрябловатой консистенции, на разрезе темно-красного цвета, пестрого вида, с мелкими желтовато-красноватыми/белесоватыми очажками. Перикард отечный, в 4 (12%) случаях утолщен.
Гистологическое исследование. При гистологическом исследовании препаратов сердца обнаружена морфология миокардита, а в некоторых случаях — сочетание миокардита с эндокардитом и перикардитом. Результаты гистологического исследования сердца 32 пациентов с тяжелой формой новой коронавирусной инфекции представлены в табл. 2.
Таблица 2. Патология сердца при COVID-19 в группе из 32 пациентов
| Вариант патологии сердца | Количество случаев |
| Миокардит, преимущественно лимфоцитарный | 32 |
| Эндокардит | 6 |
| Перикардит | 4 |
| Эндотелиит и деструктивно-продуктивный коронариит | 26 |
| Ишемические повреждения вплоть до развития очагов некроза миокарда | 14 |
| ДВС-синдром с тромбозами мелких веточек коронарных артерий, пристеночными тромбами в предсердиях, кровоизлияниями в миокарде | 29 |
В ткани миокарда отмечаются дистрофические изменения кардиомиоцитов вплоть до некроза отдельных клеток, с лизисом ядер, фрагментацией цитоплазмы и потерей поперечной исчерченности, нередко наблюдаются полосы пересокращения. Отдельные кардиомиоциты гипертрофированы. В интерстиции склероз, отек и выраженная в разной степени лимфогистиоцитарная инфильтрация (в 32 случаях количество лимфоцитов >10 на 1 мм2). В 1 случае инфильтрат с примесью небольшого количества гигантских многоядерных симпластов (рис. 2, а, б), что также косвенно подтверждает вирусную этиологию процесса. Интерстиций неравномерно расширенный, отечный. Эндотелий мелких веточек венечных артерий набухший, с лимфоидными элементами, местами веточки коронарных артерий в состоянии деструктивно-продуктивного тромбоваскулита (рис. 2, в), что является особенностью коронавирусного миокардита. Следует отметить, что морфологические признаки лимфоцитарного миокардита более ярко выражены в правых отделах сердца.
Рис. 2. Гистологическая характеристика панкардита при COVID-19.
а — лимфогистиоцитарные инфильтраты в миокарде; б — гигантские клетки типа Пирогова—Лангханса в миокарде; в — деструктивно-продуктивный тромбоваскулит мелких веточек коронарных артерий; г — лимфоидные инфильтраты в эндокарде; д — тромбоэндокардит правого желудочка; е — лимфоидные инфильтраты в перикарде. Окраска гематоксилином и эозином. а, б, е — ×40; д — ×10; в, г — ×100.
В 6 из 32 случаев обнаружены признаки тромбоэндокардита правого желудочка. Эндокард инфильтрирован лимфогистиоцитарными элементами с прилежащими тромботическими массами (рис. 2, г, д).
В 4 из 32 случаев выявлен лимфоцитарный перикардит (рис. 2, е).
Кроме того, у умерших от COVID-19 имелась также и предсуществующая патология сердца в виде хронической ИБС с постинфарктным и мелкоочаговым кардиосклерозом и атеросклероза коронарных артерий в 5 (18%) случаях, гипертонической болезни в 12 (38%) и ожирения сердца, в большинстве случаев не сочетавшегося с другими хроническими заболеваниями сердца, в 8 (27%).
3. Молекулярное и ИГХ-исследование
В 32 (100%) случаях методом РВ-ПЦР у пациентов посмертно в ткани миокарда выявлена РНК SARS-CoV-2, что подтверждает наличие генома вируса.
ИГХ-типирование клеток инфильтрата проводилось на посмертном материале ткани сердца. В препаратах сердца (в эндо-, мио- и перикарде) выявлено на 1 мм2 >7 CD3-положительных T-лимфоцитов, >14 CD45-положительных лимфоцитов и >7 CD68-положительных макрофагов. CD20-положительные B-лимфоциты отсутствовали во всех образцах (рис. 3, а—г). ИГХ-исследование белков SARS-CoV-2 проведено на материале аутопсии. Выявлена выраженная положительная экспрессия к нуклеокапсиду вируса в кардиомиоцитах и клетках инфильтрата (преимущественно в макрофагах) в миокарде (рис. 4, а, в). Положительная реакция к spike-белку обнаружена в эндотелии сосудов, клетках инфильтрата, включая инфильтрат в эндо- и перикарде (рис. 4, б, г).
Рис. 3. ИГХ-типирование клеточного инфильтрата миокарда.
а — >14 CD45-лимфоцитов на 1 мм2 в миокарде и эндокарде; б — >7 CD3 T-лимфоцитов на 1 мм2; в — >7 CD68-макрофагов на 1 мм2; г — отсутствие экспрессии CD20 B-лимфоцитов, ×40.
Рис 4. ИГХ-исследование на белки SARS-CoV-2.
а — положительная экспрессия белка нуклеокапсида SARS-CoV-2 в клетках инфильтрата в миокарде; б — положительная экспрессия spike-белка SARS-CoV-2 в эндотелии сосудов и отдельных кардиомиоцитах; в — положительная экспрессия белка нуклеокапсида SARS-CoV-2 в клетках инфильтрата в эндокарде; г — положительная экспрессия spike-белка SARS-CoV-2 в клетках инфильтрата в эндокарде; а—г — ×100.
В качестве примера приводим клинический случай пациентки, у которой ПЦР-исследование ткани сердца выявило РНК SARS-Cov-2 в миокарде.
Пациентка Н., 78 лет. Поступила с жалобами на повышение температуры тела до 39,3 °C, общую слабость, головокружение. Взятые мазки на ПЦР РНК коронавируса дважды положительны. При КТ легких в верхних и нижних долях обоих легких, больше справа, выявляются участки зоны уплотнения паренхимы по типу «матового стекла», наиболее крупные из них с ретикулярными изменениями, размеры зон достигают 7 см в максимальном измерении. Участки поражения локализованы преимущественно субплеврально в периферических отделах, отдельные — в центральных. Поражение занимает справа около 25—50%, слева до 25%. Очаговых изменений не определяется. Заключение: КТ-картина двусторонней (больше справа) полисегментарной пневмонии, вероятно, вирусной природы (в том числе Covid), КТ-2 — среднетяжелая степень. В общем анализе крови лимфопения, в биохимическом анализе — нарастание уровня лактатдегидрогеназы (до 22 950 Ед/л) и C-реактивного белка (132 мг/л). Пациентке проводилось лечение гидроксихлорохином, клексаном, цефтриаксоном, оксигенотерапия. На 20-й день госпитализации зафиксированы ухудшение состояния, резкий лейкоцитоз, признаки септического шока. Наступила биологическая смерть.
На вскрытии макроскопически легкие увеличены в размерах, массой по 2200 г, темно-красного цвета, плотноватой консистенции, с множеством суховатых вишнево-красных пестрых участков, сливающихся между собой. Гистологически во всех отделах правого и левого легких обнаружен фибринозно-геморрагический альвеолит. Альвеолярные перегородки инфильтрированы лимфогистиоцитарными элементами. Макроскопически миокард дряблой консистенции, пестрого вида, в переднеперегородочной области левого желудочка с очагом белесоватого цвета, плотной консистенции неправильной формы, размером 2,0×1,5 см. При исследовании миокарда отмечались неравномерная гипертрофия и выраженные дистрофические изменения кардиомиоцитов вплоть до лизиса ядер, воспалительная инфильтрация в стенках коронарных артерий и лимфоидная инфильтрация в интерстициальной ткани миокарда (>14 лимфоцитов в 10 полях зрения). Лимфоидная инфильтрация зафиксирована и в перикарде. Также присутствовали явления эндотелиита мелких веточек коронарных артерий, деструктивно-продуктивного коронариита. Кроме того, обнаружены обширные поля соединительной ткани на месте постинфарктного кардиосклероза, выявленного при макроскопическом исследовании. При окраске пикрофуксином по Ван-Гизону — периваскулярный и перимускулярный кардиосклероз. Для подтверждения диагноза проведено ИГХ-исследование с антителами к CD3, CD20, перфоринам, TLR-4, TLR-9. По результатам ИГХ-реакции отмечается выраженная экспрессия CD3+ лимфоцитов в интерстиции (>7 клеток на 1 мм2) и тромботических массах. CD20+ B-лимфоциты отсутствуют. NK-клетки составляют около 25% клеток инфильтрата. Отмечается выраженная экспрессия TLR 4-го типа в цитоплазме всех кардиомиоцитов, лимфомакрофагальных и лейкоцитарных элементов инфильтрата, клеток эндотелия сосудов, перицитов, а также гладкомышечных клеток сосудистой стенки. На TLR 9-го типа наблюдается слабая реакция цитоплазмы кардиомиоцитов и отдельных лейкоцитов.
Обсуждение
В проведенном исследовании представлено клиническое и морфологическое подтверждение существования миокардита, эндокардита и перикардита, вызванного SARS-CoV-2. При этом можно выделить следующие особенности SARS-CoV-2-ассоциированного поражения сердца, подтвержденного гистологическим, ИГХ-исследованием и ПЦР:
— миокардит сопровождается развитием эндотелиита и коронариита мелких веточек коронарных артерий;
— вовлечение в воспалительный процесс эндо-, мио- и перикарда с развитием коронавирусного кардита и панкардита;
— гигантоклеточная реакция в миокарде.
Присутствие РНК коронавируса в миокарде, а также белка нуклеокапсида и spike-белка в кардиомиоцитах подтверждает возможность прямого патогенного действия вируса на кардиомиоциты. Обнаружено также наличие белка нуклеокапсида и spike-белка в макрофагах инфильтрата и эндотелии микрососудов. Следовательно, можно думать о трех патогенетических механизмах развития миокардита при COVID-19: путем прямого повреждения кардиомиоцитов вирусом, ишемического повреждения, в том числе за счет коронариитов и коагулопатии с последующей воспалительной реакцией, а также вследствие выброса цитокинов клетками воспалительного инфильтрата при «цитокиновом шторме». В литературе также обсуждается механизм аутоиммунного поражения миокарда [26].
Повреждение кардиомиоцитов развивается вследствие прямого взаимодействия с вирусом. Вирус SARS-CoV-2 использует spike-белок для связывания с рецептором к АПФ2 и входа в кардиомиоцит, тем самым инициируя воспалительный процесс в миокарде. До своего связывания с рецептором spike-белок должен быть расщеплен на S1/S2-сайты (расщепление опосредуется трансмембранным сериновым белком TMPRSS2), и S2-сайт spike-белка связывается с рецептором к АПФ2 [27].
Наши данные согласуются с результатами исследования G. Tavazzi и соавт. [28], которые описывают случай вирусного миокардита, подтвержденного обнаружением РНК-вируса методом ПЦР в макрофагах в биоптате миокарда. При этом можно предположить, что локализация вируса в макрофагах может способствовать выбросу ими большого количества цитокинов, а также хронизации инфекции. Механизмы повреждения миокарда в результате выброса большого количества цитокинов также обсуждаются в литературе. Активация TLR, CLR и NOD-подобных рецепторов приводит к «цитокиновому шторму», что также остается одним из возможных путей развития миокардита. Высокие уровни цитокинов способствуют генерализации воспаления, в том числе вовлечению в воспалительный процесс миокарда. Интерлейкин-6 (ИЛ-6), являясь центральным медиатором «цитокинового шторма», организует цитокиновые реакции иммунных клеток, включая T-лимфоциты. Происходят активация T-лимфоцитов и дальнейшее высвобождение воспалительных цитокинов, которые стимулируют еще большее количество T-лимфоцитов. Возникает положительная обратная связь активации иммунной системы и повреждения миокарда. G. Chen и соавт. [29] в ходе исследования выявили высокие уровни интерлейкинов-2, -6, -10 и фактора некроза опухоли среди пациентов с коронавирусной инфекцией. Также у пациентов с COVID-19 могут развиваться фатальные аритмии, не связанные с воспалением сердца и поражением непосредственно кардиомиоцитов, а ассоциированные, например, с аритмогенными провоспалительными цитокинами или перикардитом/коронариитом [30].
Для детальной характеристики точного механизма повреждения миокарда, связанного с COVID-19, необходимы дальнейшие про- и ретроспективные когортные исследования, что возможно только в условиях тесного взаимодействия между морфологами и кардиологами.
Выводы
1. Доказано существование вирусного миокардита при COVID-19 по данным клиники, морфологии, а также на основании обнаружения белка нуклеокапсида и spike-белка SARS-CoV-2 в кардиомиоцитах, клетках воспалительного инфильтрата и эндотелии сосудов.
2. Особенностью SARS-CoV-2-ассоциированного миокардита является его сочетание с коронариитом и ДВС-синдромом.
3. Выявлено, что при коронавирусном поражении сердца могут развиться миокардит, эндо-, перикардит и панкардит.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Е.А. Коган, А.Д. Куклева
Сбор и обработка материала — Е.А. Коган, Ю.С. Березовский, О.В. Благова, Д.Х. Айнетдинова, А.Д. Куклева, Г.А. Демяшкин
ИГХ-исследование — Н.В. Жарков, А.Д. Куклева
Статистическая обработка — Е.А. Коган, А.Д. Куклева
Написание текста — О.В. Благова, А.Д. Куклева, Г.А. Демяшкин
Редактирование — Е.А. Коган
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ №20-315-90021/20.